Clinical features and tubulin folding cofactor E gene analysis in Iranian patients with Sanjad-Sakati syndrome / Características clínicas e análise genética e de cofatores de dobramento da tubulinaem pacientes iranianos com síndrome de Sanjad-Sakati

Abstract Objective Permanent hypoparathyroidism can be presented as part of genetic disorders such as Sanjad-Sakati syndrome (also known as hypoparathyroidism—intellectual disability-dysmorphism), which is a rare autosomal recessive disorder. Our aim was to confirm the diagnosis of a group of patients with dysmorphism, poor growth, and hypoparathyroidism clinically labeled as Sanjad-Sakati syndrome and to identify for the first time the genetic variations on Iranian patients with the same ethnic origin. Methods In this study, 29 cases from 23 unrelated Arab kindreds with permanent hypoparathyroidism and dysmorphism indicating Sanjad-Sakati syndrome were enrolled for 10 years in the southwest of Iran. The mutational analysis by direct sequencing of the tubulin folding cofactor E gene was performed for the patients and their families, as well as their fetuses using genomic DNA. Results Twenty-eight out of 29 cases had parental consanguinity. Twenty-seven cases presented with hypocalcemia seizure and two were referred because of poor weight gain and were found to have asymptomatic hypocalcemia. The dysmorphic features, hypocalcemia in the setting of low to normal parathyroid hormone levels and high phosphorus led to the diagnosis of these cases. Sequencing analysis of the tubulin folding cofactor E gene revealed a homozygous 12-bp deletion (c.155-166del) for all patients. Following that, prenatal diagnosis was performed for eight families, and two fetuses with a homozygous 12-bp deletion were identified. Conclusion These results make it much easier and faster to diagnose this syndrome from other similar dysmorphisms and also help to detect carriers, as well as prenatal diagnosis of Sanjad-Sakati syndrome in high-risk families in this population.

Resumo Objetivo O hipoparatireoidismo permanente pode estar presente como parte das doenças genéticas como na síndrome de Sanjad-Sakati (também chamada de síndrome de hipoparatireoidismo, retardo e dismorfismo), que é um distúrbio autossômico recessivo raro. Nosso objetivo foi confirmar o diagnóstico de um grupo de pacientes com dismorfismo, crescimento deficiente e hipoparatireoidismo clinicamente identificado como síndrome de Sanjad-Sakati e identificar as variações genéticas, pela primeira vez, em pacientes iranianos com a mesma origem étnica. Métodos Neste estudo, foram inscritos 29 casos de 23 famílias árabes sem parentesco com hipoparatireoidismo e dismorfismo indicando síndrome de Sanjad-Sakati, durante 10 anos no sudoeste do Irã. Foi feita a análise mutacional por sequenciamento direto do gene do cofator E de dobramento da tubulina dos pacientes e de suas famílias e também de seus fetos com o DNA genômico. Resultados Apresentaram consanguinidade parental 28 dos 29 casos. Desses, 27 casos apresentaram convulsão por hipocalcemia e dois foram encaminhados devido ao baixo ganho de peso, considerando diagnóstico de hipocalcemia assintomática. As características dismórficas, hipocalcemia na configuração de níveis de hormônio da paratireoide baixos a normais e alto nível de fósforo levaram ao diagnóstico dos casos. A análise de sequenciamento do gene do cofator E de dobramento da tubulina revelou deleção homozigótica de 12 pares de base (pb) (c.155-166del) em todos os pacientes. Após isso, foi feito o diagnóstico pré-natal em oito famílias e dois fetos foram identificados com deleção homozigótica de 12 pb. Conclusão Esses resultados tornam o diagnóstico dessa síndrome muito mais fácil e rápido do que outros dismorfismos semelhantes e também ajudam a detectar portadores, bem como o diagnóstico pré-natal da síndrome de Sanjad-Sakati em famílias de alto risco nessa população.

Modelamiento proteico de la Tubulina de G. lambliapor homología de secuencias / Protein modeling of G. Lamblia Tubulin through sequence homology

La Giardiasis ocasionada por Giardia intestinalis (conocida como Giardia lamblia), es una de las infecciones parasíticas más comunes en todo el mundo y con mayor prevalencia en países en desarrollo como el nuestro. Existen muchas drogas para el tratamiento de la giardiasis, de diferente eficacia y efectos adversos como la curcumina que inhibe la polimerización de los microtubulos por un mecanismo distinto al de la colchicina. Sin embargo, la estructura cristalográfica de la Tubulina de G. lamblia (cadenas α y ß) permanece desconocida. El análisis de alineamiento de secuencias (PBLAST) indica una identidad del 86,98 y 88,32 % entre las cadenas α y ß de la Tubulina de G. lamblia y B. taurus (PDB:5NQT). El Modelamiento por Homología de la estructura proteica de la Tubulina de G. lamblia utilizando como molde a la Tubulina de B. taurus mediante el servidor SWISS-MODEL, generó una estructura proteica con los siguientes parámetros: z-core = -1,16 y -1,41, QMEANscore6 = 0,71 y 0,70, % de confiabilidad (de los diagramas de Ramachandran) = 96,08 y 96,95 %, RMS (Root Mean Square) = 0,081 y MOLPROBITYscore = 1,26. Estos parámetros indican que la estructura proteica de la Tubulina de G. lamblia obtenida a partir del Modelamiento por Homología es de buena calidad, por tanto, esta estructura podría ser utilizada en futuras evaluaciones, como el análisis in silico de compuestos antiGiardia.

Giardiasis caused by Giardia intestinalis (known as Giardia lamblia), is one of the most common parasitic infections in the world and with a higher prevalence in developing countries like ours. There are many drugs for the treatment of giardiasis, of different efficacy and adverse effects such as curcumin that inhibits the polymerization of microtubules by a mechanism other than colchicine. However, the crystallographic structure of G. lamblia Tubulin (α and ß chains) remains unknown. The sequence alignment analysis (PBLAST) indicates an identity of 86,98 and 88,32 % between the α and ß chains of the Tubulin of G. lamblia and B. taurus (PDB: 5NQT). Homologous Modeling of the protein structure of G. lamblia Tubulin using the B. taurus Tubulin as a template employing the SWISS-MODEL server, generated a protein structure with the following parameters: z-core = -1,16 and -1,41, QMEANscore6 = 0,71 and 0,70, % of reliability (from Ramachandran plots) = 96,08 y 96,95 %, RMS (Root Mean Square) = 0,081 and MOLPROBITYscore = 1,26. These parameters indicate that the protein structure of G. lamblia Tubulin obtained from Homology Modeling is of good quality, therefore, this structure could be used in further evaluations, such as the in silico analysis of antiGiardia compounds.

Evaluación de diferentes métodos de extracción de ARN a partir del hongo nativo Xylaria sp / Evaluation of different RNA extraction methods from the native fungus Xylaria sp

RESUMEN La extracción de ARN de calidad constituye el primer paso para el análisis de la expresión génica. Sin embargo, su obtención no es sencilla debido a la susceptibilidad de esta molécula a la presencia de contaminantes como ARNasas, proteínas y polisacáridos. Adicionalmente, debido a la diversa composición de la pared celular de los hongos se requiere optimizar los procesos de extracción de ARN para organismos específicos. Este estudio evalúo el uso de diferentes metodologías de homogeneización de tejido (nitrógeno líquido y liofilización) y extracción de ARN (Trizol, CTAB y RNeasy mini kit) a partir del hongo nativo ascomiceto Xylaria sp. Se determinó la pureza, concentración e integridad del ARN obtenido por medio de espectrofotometría y electroforesis. Adicionalmente, se diseñaron cebadores de referencia para el gen β-Tubulina a partir del alineamiento de secuencias de este gen obtenidas de diferentes ascomicetes. Estos cebadores fueron utilizados para evaluar si el ARN extraído es amplificable mediante RT-PCR. Se determinó que la homogeneización de tejido por medio de liofilización generó mayores rendimientos de extracción independientemente del protocolo de extracción utilizado; sin embargo, éstos alteraron la integridad del ARN. Se obtuvo un ARN con mayor pureza con el protocolo CTAB y un mayor rendimiento con el RNeasy mini kit. Los resultados indican que el ARN extraído, independientemente de la metodología de homogeneización y extracción utilizada, es amplificable mediante RT-PCR. No obstante, se recomienda homogeneizar el tejido con nitrógeno líquido y extraer con RNeasy mini kit por la brevedad del protocolo de extracción y calidad obtenida.

ABSTRACT Obtaining high quality RNA is the first step for gene expression analysis. However, the low stability of this molecule and high presence of contaminants such as RNases, proteins and polysaccharides may trouble extractions. Fungi cell wall composition is highly diverse; therefore optimizing RNA extraction procedures is necessary when studying specific organisms. In this study, different methods of tissue homogenization (liquid nitrogen and lyophilization) and RNA extraction (Trizol, CTAB and RNeasy mini kit) were assessed with a native ascomycete, Xylaria sp. RNA purity, concentration and integrity were determined by spectrophotometry and electrophoresis. In addition, a set of housekeeping gene primers was designed targeting the β-tubulin gene. The primers were used to determine if the RNA extracted allowed RT-PCR amplification. It was demonstrated that homogenization of tissue by lyophilization allowed higher yields of RNA regardless of the extraction protocol used, however, the RNA integrity was affected. The higher RNA purity was obtained using CTAB and the higher yields using the RNeasy mini kit. The extracted RNA is amplifiable by RT-PCR regardless of the homogenization and extraction methodology used. However, it is recommended to homogenize the tissue with liquid nitrogen and to extract RNA with the RNeasy mini kit due the shortness and efficiency of these protocols.

Beta-tubulin expression In the hippocampus Of patients with mesial temporal lobe epilepsy / Expressão de beta-tubulina no hipocampo de pacientes com epilepsia do lobo temporal mesial / Expresión de beta-tubulina en el hipocampo de los pacientes con epilepsia del lóbulo temporal mesial

Introduction: The neuronal loss and abnormal mossy fibers sprouting are frequently observed in patients with mesial temporal lobe epilepsy (MTLE). Beta-tubulin, a cytoskeleton protein, is critical for the maintenance of the neuritic structure. Objective: Considering the axonal reorganization in patients with MTLE, our objective was to analyze the beta-tubulin expression in the hippocampus of these patients. Methods: We evaluated the hippocampus of 38 MTLE patients and seven control cases. Histological sections were submitted to neo-Timm histochemistry to evaluate the sprouting of mossy fiber, and to immunohis- tochemistry for neuronal density evaluation (NeuN) and beta-tubulin expression. Results: The MTLE group showed lower neuronal density than the control group in the granular layer (GL), hilus, CA4, CA3, CA1, and presubiculum. The MTLE group showed higher gray value on the neo-Timm staining when compared to the control group in GL, IML, and outer mo- lecular layer (OML), and sprouting of thicker mossy fibers in the IML. When compared to the control group, group MTLE showed higher beta-tubulin expression in GL and lower expression in CA3 region. The aberrant sprouting of mossy fibers correlated inversely with the beta-tubulin expression in several subs of the hippocampal formation. Conclusions: The differential expression of beta-tubulin in the regions CA3 and GL of the MTLE group, as well as its correlation with neuronal loss and the mossy fiber sprouting, suggests a possible role of this protein in the neuropathological changes that occur in the hippocampus in chronic cases of MTLE.

Introdução: A perda neuronal e o brotamento anormal de fibras musgosas são observados com frequência em pacientes com epilepsia do lobo temporal mesial (ELTM). A beta-tubulina, uma proteína do citoesqueleto, é essencial para a manutenção da estrutura neurítica. Objetivo: Considerando a reorganização axonal nos pacientes com ELTM, nosso objetivo foi analisar a expressão de beta-tubulina no hipo- campo desses pacientes. Métodos: Foram avaliados 38 hipocampos de pacientes com ELTM e sete casos controle. Cortes histológicos foram submetidos à histoquímica de neo-Timm para avaliação do neobrotamento de fibras musgosas e à imuno-histoquímica para avaliações da densidade neuronal (NeuN) e da expressão de beta-tubulina. Resultados: O grupo ELTM apresentou menor densidade neuronal do que o grupo controle na camada granular (CG), hilo, CA4, CA3, CA1 e no pró-subículo. O grupo ELTM apresentou maior valor de cinza na coloração neo-Timm com relação ao grupo controle na CG, CMI e camada molecular externa (CME) e neobrotamento mais espesso de fibras musgosas na CMI. O grupo ELTM apresentou maior expressão de beta-tubulina na CG e menor expressão na região de CA3, quando comparado ao grupo controle. O neobrotamento aberrante de fibras musgosas correlacionou-se inversamente com a expressão de beta-tubulina em diversos subcampos da formação hipocampal. Conclusões: A expressão diferencial da beta-tubulina nas regiões da CA3 e CG do grupo ELTM, assim como suas correlações com a perda neuronal e o neobrotamento de fibras musgosas sugerem uma possível participação dessa proteína nas alterações neuropatológicas que ocorrem no hipocampo nos casos crônicos de ELTM.

Introducción: La pérdida neuronal y la brotación anormal de fibras musgosas se observan con frecuencia en los pacientes con epilepsia del lóbulo temporal mesial (ELTM). La beta-tubulina, una proteína del citoesqueleto, es crítica para el mantenimiento de la estructura neurítica. Objetivo: Teniendo en cuenta la reorganización axonal en pacientes con ELTM, nuestro objetivo fue analizar la expresión de beta-tubulina en el hipocampo de estos pacientes. Métodos: Se evaluó el hipocampo de 38 pacientes con ELTM y siete casos de control. Cortes histológicos fueron sometidos a la histoquímica neo-Timm para evaluar la brotación de fibras musgosas, y a inmunohistoquímica para la evaluación de la densidad neuronal (NeuN) y la expresión de beta-tubulina. Resultados: El grupo ELTM mostró una menor densidad neuronal que el grupo control en la capa granular (CG), hilo, CA4, CA3, CA1 y pró-subículo. El grupo ELTM mostró mayor valor de gris en la tinción neo-Timm en comparación con el grupo control en CG, CMI y en la capa externa molecular (CME), y la brotación de fibras musgosas más gruesas en la CMI. El grupo ELTM mostró una mayor expresión de beta- tubulina en CG y expresión más baja en la región CA3, cuando se compara con el grupo control. La brotación aberrante de fibras musgosa está inversamente correlacionada con la expresión de beta-tubulina en varios subcampos de la formación del hipocampo. Conclusiones: La expresión diferencial de beta-tubulina en las regiones CA3 y CG del grupo ELTM, así como su correlación con la pérdida neuronal y el surgimiento de fibras musgosas, sugiere un posible papel de esta proteína en los cambios neuropatológicos que se producen en el hipocampo en los casos crónicos de ELTM.

Identificação e validação funcional de novos alvos das PKCs em célula tronco embrionária / Identification and functional validation of new targets of PKC in embryonic stem cell

Algumas das estratégias utilizadas para entender a biologia de células tronco embrionária (CTE) são baseadas na identificação de cascatas de sinalização que induzem a diferenciação e auto-renovação das CTE através da interferência seletiva de processos específicos. A família das proteínas quinase C (PKC) é conhecida por participar dos processos de auto-renovação e diferenciação celular em CTE, entretanto, o papel específico das diferentes isoenzimas das PKCs ainda precisa ser elucidado. Desta forma investigamos. o papel das PKCs atípicas (aPKCs) em CTE indiferenciadas utilizando um inibidor específico para estas serina/ treonina quinases, o peptídeo pseudossubstrato das aPKCs, e fosfoproteômica. A maioria das proteinas identificadas cuja fosforilação reduziu após o tratamento com o inibidor das aPKC, são proteínas envolvidas com o metabolismo principalmente com a via glicolítica. Além disso, a inibição das aPKCs levou a redução do consumo de glicose, secreção de lactato, acompanhada da redução da atividade da lactato desidrogenase, e aumento da fosforilação oxidativa, sendo analisada através do consumo de oxigênio após o tratamento com oligomicina e FCCP. Verificamos também que as aPKCs são capazes de fosforilar diretamente a piruvato quinase. A glicólise aeróbica parece ser fundamental para a manutenção da indiferenciação das CTE, e demonstramos que as aPKCs participam deste processo auxiliando na auto-renovação das CTE indiferenciadas. Também observamos que as aPKCs assim como a PKCßI modulam a fosforilação da α-tubulina, porém ao passo que as aPKCs interagem com a α-tubulina durante a interfase, a PKCßI interage com a mesma apenas durate a mitose. Estes resultados motivaram a segunda parte da tese, na qual o papel da fosforilação da α-tubulina pela PKCßI foi investigado. O resíduo de treonina 253, conservado em diversas espécies de vertebrados e localizado na interface de polimerização entre a α- e a ß-tubulina foi identificado, como um novo sítio de fosforilação da α-tubulina pela PKCßI. Este sítio não está em um consenso linear para a PKC, entretanto é um consenso formado estruturalmente, onde aminoácidos básicos distantes na sequência linear se tornam justapostos na estrutura terciária da proteína. Estudos de simulação por dinâmica molecular demonstraram que a interação entre a α e ß-tubulina aumenta após esta fosforilação, uma vez que T253 fosforilada passa a interagir com K105, um residuo conservado na ß-tubulina. A fosforilação in vitro de α-tubulina aumenta a taxa de polimerização da tubulina e a inibição da PKCßI em células reduziu a taxa de repolimerização do microtubulo após o tratamento com nocodazol. Além disso, a importância da fosforilação deste sítio foi demonstrada pelo fato de que um mutante fosfomimético GFP-α-tubulina, T253E ser mais incorporado no fuso mitótico ao passo que T253A foi menos incorporado do que a proteína selvagem. Nossos dados suportam a hipótese que os consensos estruturais formados podem ser importantes sítios de reconhecimento pelas quinases e que a fosforilação de T253 da α-tubulina afeta a estabilidade do polímero. Em conclusão, utilizando métodos de fosfoproteômica e interferência seletiva de vias de sinalização, combinados a validações experimentais dos alvos identificados podemos propor a importância funcional das aPKCs e PKCßI em CTE indiferenciadas

Some of the strategies used to understand stem cell biology are based on the identification of signalling cascades that lead to differentiation and self-renewal of embryonic stem cells (ESC) by selective interference of specific signalling processes. The protein kinase C (PKC) family is known to participate in ESC self-renewal and differentiation, however, the specific role of the different PKC isoenzymes in these cells remains to be determined. Therefore, we investigated the role of atypical PKCs (aPKC) in undifferntiated ESC using a specific inhibitor for these serine/ threonine kinases, pseudo-substrate peptide of aPKCs, and phosphoproteomics. The majority of proteins whose phosphorylation decreased upon aPKC inhibition, are proteins involved in metabolism in particular with the glycolytic pathway. Besides that, inhibiton of aPKCs led to a decrease in glucose uptake and lactate secretion, followed by a decrease in lactate dehydrogenase activity, and an increase in mitochondrial activity as measured by oxygen consumption after treatment with olygomycin and a chemical uncoupler. We also verified that aPKCs are able to directly phosphorylated pyruvate kinase. Aerobic glicolysis seems to be fundamental for the maintainance of undifferentiated ESC, and we demonstrated that aPKCs participte in these processes helping to maintain self-renewal of undifferentiated ESC. We also observed that aPKCs as PKCßI modulate the phosphorylation of α-tubulin, however, while aPKCs interact with α-tubulin during interfase PKCßI interacts with α-tubulin only during mitosis. These results lead to the second part of this thesis. We investigated the role of α-tubulina phosphorylation by PKCßI. Indentifying threonine 253, a conserved residue in several vertebrate species, of localized at the polymerization interface between α- and ß-tubulin, as a phosphorylation site of α-tubulin by PKCßI. This site is not in a linear consensus for PKC, however, it is in a structuraly formed consensus, where basic aminoacids distant in the linear sequence are juxtaposed in the three dimentional protein structure. Simulation studies by molecular dynamics show that the interaction between α and ß-tubulin increases upon this phosphorylation, once, phosphorylated T253 interacts with com K105, a conserved residue in ß-tubulin. The in vitro phosphorylation of α-tubulin increased tubulin polymerization rate and inhibiton of PKCßI in cells reduced repolimeration rate of microtubles upon treatment with nocodazole. Besides that, the importance of this phosphorylation site were demonstrated by the fact that a phosphomimetic mutant GFP-α-tubulina, T253E is more incorporated in mitotic fuses while T253A is less than wild type. Our data support the hypothesis that structural consensus may be important sites recognized and that T253 phosphorylation of α-tubulin afects the polymer stability. In conclusion, using phosphoproteomics methods and selective interference of signal transduction pathways combined with experimental validation studies of the identified targets we can propose roles for aPKCs and PKCßI in undifferentiated ESC

Principales marcadores moleculares utilizados para la identificación de Babesia bovis y Babesia bigemina / Principal molecular markers used to identify Babesia bovis and Babesia bigemina

Este artículo describe los principales marcadores moleculares utilizados para la identificación de B. bovis y B. bigemina reportados en la literatura científica. Para ello se diseñó una revisión sistemática a partir de la aplicación de la estrategia metodológica PICO modificada con el objetivo de definir las secuencias nucleotídicas detectadas en los diferentes sitios geográficos y su utilidad diagnóstica. Se realizó una búsqueda avanzada con los términos “Babesia bovis” y “DNA” y “Babesia bigemina” y “DNA” en las bases de datos ScienceDirect, SpringerLink y PubMed que después de ser filtradas permitieron obtener un resultado total de 68 artículos originales. Tanto los artículos incluidos como los excluidos fueron almacenados en tablas, en las cuales se presenta la justificación de su condición dentro del estudio. A los 68 artículos seleccionados se les aplicó una evaluación con criterios de inclusión y exclusión previamente definidos, de este modo, 21 artículos originales cumplieron con los criterios de inclusión y se incluyeron en el estudio. Se describe la utilidad de los marcadores moleculares referenciados en la literatura científica desde 1995 hasta el 2010: la subunidad pequeña RNAr, el gen citocromo b, gen msa-1 and msa-2c, el gen Bv, el factor de elongación alfa (EF-1α), el gen de la beta-Tubulina, SBP 1-2-3, y los RAP; su aplicación diagnóstica y su utilización en los diferentes sitios geográficos. Los marcadores moleculares utilizados para la detección de las babesias bovinas varían dependiendo de la región geográfica, grado de conservación genética y resultados de estudios previos que concluyen su utilidad diagnóstica.

A PCR assay for the identification of Leishmania species of the Viannia subgenus / Un ensayo de PCR para identificar especies de Leishmania del subgénero Viannia

We have identified a novel DNA sequence of 500 bp (β500-DNA) on the Leishmania (Viannia) subgenus, located in the intergenic region of one of the loci of the β-tubulin gene family. The sequence analysis showed that this sequence has no homology to any other sequence described so far, including the β-tubulin gene. We improved a specific β500-PCR assay, which generated a PCR product of 375 bp for total genomic DNA from Leishmania strains belonging to the L. (Viannia) subgenus. In contrast, no amplification was found when using genomic DNA from species of L. (Leishmania) subgenus or other organisms. Under our PCR conditions, the lower detection limit was 1 fg when a purified DNA clone (pLgβ4), which contains one copy of the β500-DNA sequence, was used. The β500-DNA PCR assay confirmed the preliminary diagnosis of cutaneous leishmaniasis in clinical samples in which the Montenegro skin test was positive and parasite cultures were negative. The analytical specificity and the sensitivity of the PCR assay provide a tool for epidemiological studies of the disease.

En este trabajo identificamos una nueva secuencia de DNA de 500 pb (β500-DNA) en Leishmania del subgénero Leishmania (Viannia), localizada en la región intergénica de uno de los loci de la familia de los genes de la β tubulina. El análisis de secuencia mostró que β500 no tiene homología con ninguna otra secuencia previamente descrita, incluido el gen de la β tubulina. Nosotros implementamos un ensayo de PCR específico para β500, β500-PCR, que genera un producto de PCR de 375 pb a partir del DNA genómico de cepas de Leishmania pertenecientes al subgénero L. (Viannia). No hubo amplificación alguna cuando se utilizó el DNA genómico de especies del subgénero L. (Leishmania) o el de otros organismos. En las condiciones establecidas, utilizando DNA purificado del clon pLgβ4, que contiene una copia de la secuencia de DNA de β500, el límite de detección más bajo fue de 1 fentogramo. El ensayo β500-PCR confirmó el diagnóstico preliminar de leishmaniasis cutánea en muestras clínicas de pacientes positivas a la prueba de Montenegro y negativas en el cultivo de parásitos. La especificidad y sensibilidad analítica del ensayo de PCR proporciona una herramienta para estudios epidemiológicos de la enfermedad.